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Selección y Clonación in vitro de Genotipos Promisorios de Agave cocui trelease

INVESTIGADOR: Ing. Agr. Lianette Yépez
FECHA: Febrero 2004

RESUMEN

Con el propósito de seleccionar “individuos promisorios” y establecer un sistema de Propagación clonal in vitro se caracterizó una población nativa de Agave cocui Trelease considerando criterios morfológicos, fisiológicos, bioquímicas y moleculares, procedentes de seis (6) sectores (Norte (n), Sur (S), Este (E), Oeste (O), Sur Este (SE) y Vertiente Sur (VS) de “La Cienéga”, Cerro “La Horqueta” a 320 msnm y a 4 Km al oeste  de Pecaya, Municipio Sucre, Estado Falcón. Se colectaron 194 plantas juveniles y se apreció que en su hábitat natural desarrollaron mas altura las que procedieron de los sectores N (14,30 cm), S (14,35 cm) y O (14,38cm), plántulas que produjeron mas hojas en los sectores E (5,03 hojas), SE (5,15 hojas) y VS (4,08 hojas) y plántulas de grosor (26,74cm) en el sector O. Durante el establecimiento en condiciones de vivero en el Instituto de Biología Experimental de la UCV, Caracas se evaluó el crecimiento en términos de número de hojas nuevas por mes en 175 plantas no encontrándose correlación entre dicha variable de crecimiento & la oscilación de acidez titulable y la acumulación de los  azucares totales. Mediante un análisis de correlación canónica se determino un grupo de individuos “promisorios” (N101, S183, E140, E141, E150, ; 080, 088,  0110, 0112, SE161, SE163, VS2, VS9. VS18) puesto que produjeron valores de oscilación de acidez titulable y acumulación de azúcares totales por encima del promedio. La caracterización molecular se realizo en 64 individuos & siete (7) indicadores (OPM09, OPM02, OPD05, OPM07, OPL13, OPA19, OPD16) u revelo la presencia de 423 fragmentos de ADN cuyos pesos moleculares oscilaron entre 200pb y 2072 pb,  además, se encontró un elevado polimorfismo genético (81,3%). y un alto índice de diversidad en las poblaciones estudiadas dentro y entre los sectores de muestreo. Se obtuvieron patrones RAPD´s de muestras de ADN amplificado de hijos apomícticos de A. Cocui que mostraron bandas polimórficas, lo cual permitió inferir que la variabilidad genética observada en los individuos colectados en campo podría deberse a variación relacionada con la apomixia.  

La propagación clonal in vitro de la especie A. Cocui se logro mediante organogénesis directa e indirecta. Se utilizó la selección basal de bulbilos para inducir brotes directos y las hojas de vitroplantas para inducir solo tejido de callo. La formación directa de brotes sobre el tejido se indujo en el medio de cultivo de (MS1) (1965) y el MS2 (1965) modificado según los requerimientos nutricionales de la especie en su ambiente natural y, para la inducción de callo se uso el medio de MS (1962) los cuales se combinaron con diferentes concentraciones de sustancias del crecimiento vegetal. Doce semanas después se obtuvieron sobre el tejido un promedio de 37 brotes directos nuevos por explante en MS2 y altas concentraciones de BA (10 mg/l) y la formación de callo se logró en el 48% de los explantes cinco (5) semanas después de la siembra in vitro en presencia de 1 mg/l 2,4 – D y 1 mg/l BA, todos bajo condiciones de luz continua. Secciones de aproximadamente 0,75 cm2 del callo se transfirieron en la misma combinación hormonal donde el callo desarrolló estructuras nodulares verdes que fueron transferidas, 5 semanas después para un medio de cultivo con altas concentraciones de BA (10 mg/l) en ausencia de auxinas. Se duplicó el coeficiente de multiplicación en los medio de cultivo probados en etapa de multiplicación y en todas las combinaciones hormonales independientemente de la fecha del contaje, del medio de cultivo, de las combinaciones hormonales y de los subcultivos realizados.. El enraizamiento se realizó en un periodo de 4-6 semana en medios de cultivo con la mitad de la concentración de las sales de MS (1965) en presencia auxina (AIB y ANA) y carbón activado. Las vitroplantas con raíces y mas de cms de altura se aclimataron, satisfactoriamente en un sustrato compuesto por suelo nativo (procedente de Pecaya) rico en arena y comprobadamente micorrízico en combinación con abona tipo Bocashi.

CONCLUSIONES

  • Se encontraron variaciones en las medidas morfométricas iniciales (número de hojas presentes, altura de la planta y grosor de la base) tomadas en el momento la colecta asociadas con los sectores de muestreo.
  • Se apreció la presencia de dos (2) grupos de plantas: plantas con mayor número de hojas presentes, menor espesor en la base y de menor altura (sectores E, SE y VS) y plantas con menos hojas pero con mayor grosor en la base y mayor altura (sectores N,O y S).
  • La variable de crecimiento producción de hojas nuevas por mes considerada durante el establecimiento en vivero de la especie A. Cocui no fue indicadora de3 la acumulación diaria de acidez y azúcares.
  • El análisis del curso diario de acidez titulable revelaron que las poblaciones de A. Cocui que provienen del N, O, SE, y VS son iguales estadísticamente pero diferentes a las plantas del sector S y del E.
  • Los valores promedios de oscilación de acidez titulable obtenidos en las poblaciones de A. Cocui evaluadas revelaron que las plantas parecen estar efectuando CAM pero débilmente en las condiciones de crecimiento proporcionadas en el vivero.
  • El análisis de la acumulación de azúcares totales confirmó la separación de las plantas según la producción de azúcares en tres grupos:
  • potencial bajo como productoras de azúcares: plantas del sector S,
  • potencial medio de producción de azúcares: plantas de los sectores SE, E Y N,
  • potencial alto como productoras de azúcares: VS y O
  • Se encontró un grupo de individuos que bien pudieran catalogarse como “promisorios” (N101; S183; E140; E141; E150; O80; O88; O110; O112; SE161; SE163; VS2; VS9; VS18) en lo que respecta a la oscilación promedio de oscilación de acidez titulable y producción de azúcares totales.
  • El protocolo estandarizado para la extracción y cuantificación del ADN de muestras de Agave cocui resulto efectivo para efecto de la aplicación de la técnica RAPD´s.
  • El diseño de la reacción de PCR resultó adecuado para lograr bandas de ADN amplificables y de alta resolución, características indispensable para un adecuado análisis de los resultados.
  • El análisis de las matrices de datos de 64 individuos de A. Cocui provenientes de 6 sectores de muestreo (N,S,E, O, SE Y VS) y 7 iniciadores (OPM09, OPM07, OPL13, OPD05, OPA19, OPD16, OPO 02) revelaron un total de 423 fragmentos de ADN cuyos pesos moleculares oscilaron entre 200 pb y 2072 pb.
  • Se encontró un elevado polimorfismo genético (81,3%). y un alto índice de diversidad en las poblaciones estudiadas dentro y entre los sectores de muestreo.
  • Los iniciadores OPM09 OPM07 OPD05 OPO02 fueron eficientes en mostrar polimorfismo lo cual se confirmo con el índice de diversidad obtenido.
  • Se obtuvieron patrones RAPD´s de muestras de ADN amplificado de hijos apomícticos de A. Cocui que mostraron bandas polimórficas, lo cual permite inferir que la variabilidad genética observada en los individuos colectados en campo podría deberse a variación relacionada con la apomixia.
  • La propagación clonal in vitro de la especie A. Cocui fue factible mediante organogénesis directa a partir de explantes de la parte basal del bulbulio.
  • La organogénesis directa sobre explantes de la base del bulbilo se vio favorecida por uso de 2,4 -D (0.025 mg/l) y altas concentraciones de BA(10 mg/l) bajo condiciones de luz continua y en combinación con el medio de cultivo MS2 modificado en el balance nitrato/amonio y en las ión fosfato y sulfato, magnesio y boro ión fosfato y sulfato magnesio y boro.
  • La multiplicación in vitro de A. Cocui parece más eficiente en el medio de cultivo MS1 (1962) que en MS2 (Díaz y col, 1998) en condiciones de fotoperíodo, sin embargo hay que considerar los factores intensidad de luz, combinación de reguladores de crecimiento, número de subcultivos y tiempo entre subcultivos a la hora de evaluar la respuesta en ambos medios de cultivo.
  • Se duplicó el coeficiente de multiplicación en los medios de cultivo probados en la etapa de multiplicación y en todas las combinaciones hormonales independientemente de la fecha del contaje, del medio de cultivo, de las combinaciones hormonales y de los subcultivos realizados.
  • Es factible considerar la realización de subcultivos entre la semana 8 y 12 después del inicio de la fase de multiplicación.
  • La presencia del bencil aminopurina (BA) en dosis de 2 y 10 mg/l parecen ser mas efectivas para la multiplicación de brotes que las dosis de Kinetina de 1 g/L.
  • Se logro la inducción y multiplicación de brotes de A. Cocui en medio de cultivo MS2(Díaz y col, 1998) en ausencia de hormonas.
  • El enraizamiento in vitro de A. Cocui se mostró favorecido por el medio de cultivo de 50% sales de MS (1965) + 15 g/L de azúcar y la presencia de auxinas (AIA, AIB) en dosis de 0.25 mg/l sin CA.
  • El carbón activado promovió el crecimiento en longitud tanto de la parte aérea como radical más que comportarse como una sustancia inductora del enraizamiento.
  • El número de hojas nuevas, el desarrollo del sistema radical y la ganancia en altura producidos durante la etapa de enraizamiento in vitro de A. Cocui fueron variables importantes a considerar como una expresión del vigor de la vitroplanta.
  • La aclimatación de las vitroplantas de A. Cocui se apreció favorable en términos de crecimiento del vástago u la raíz en presencia de sustratos con abono orgánico tipo bocashi y suelo nativo comprobadamente micorrízicos.

 

Última actualización en Viernes, 17 de Septiembre de 2010 10:25